PCR (полимеразна верижна реакция). Как се диагностицира PCR, как да се подготви за изследването, резултата от PCR

За адекватното и ефективно лечение на много инфекциозни заболявания е необходимо да се създаде точна диагноза своевременно. В решаването на този проблем се използват високотехнологични диагностични методи, базирани на методи на молекулярната биология. Понастоящем полимеразната верижна реакция (PCR) вече се използва широко в практическата медицина като най-надежден лабораторен диагностичен инструмент.

Съдържание на страницата

• 1 Какво обяснява популярността на PCR в този момент?
• 2 Каква е същността и механиката на PCR диагностиката?
• 3 PCR диагностиката е генетично изследване на биоматериал.
• 4 Етапи на изследване на PCR
• 5 Събиране на биологичен материал за изследване
• 6 Етапи на незабавна реакция на PCR, копиране на генетичен материал
• 7 Степента на идентификация на умножения генетичен материал
• 8 Защо PCR диагностиката е толкова ценна?

Какво обяснява популярността на PCR в този момент?

Първо, този метод се използва за идентифициране на причинителите на различни инфекциозни заболявания с висока точност.

На второ място, да се наблюдава ефективността на лечението.

В различни ръководства, проспекти, статии, както и обяснения на медицински специалисти, често срещаме използването на неразбираеми думи и думи. Наистина е трудно да се говори за високотехнологични научни продукти с ежедневни думи.

Каква е същността и механиката на PCR диагностиката?

Всеки жив организъм има свои собствени уникални гени. Гените се намират в молекулата на ДНК, която всъщност е „визитната картичка“ на всеки конкретен организъм. ДНК (генетичен материал) е много дълга молекула, която се състои от „тухли“, наречени нуклеотиди. Всеки патоген на инфекциозни заболявания се намира строго специфичен, т.е. в определена последователност и комбинация. Когато е необходимо да се разбере дали присъства определен патоген, се събират биологични материали (кръв, урина, слюнка, намазка), които съдържат ДНК или фрагменти от ДНК на микробите. Но количеството на генетичния материал на патогена е много малко и е невъзможно да се каже кой микроорганизъм принадлежи. За решаването на този проблем се използва и PCR. Същността на полимеразна верижна реакция е, че малко количество материал се взема за изследване, съдържащ ДНК, и процесът PCR увеличение на броя на генетичен материал, принадлежащи към конкретен патоген и по този начин, може да бъде идентифициран.

PCR диагностиката е генетично изследване на биоматериал.

Идеята за метода на PCR принадлежи на американския учен К. Мълинс, когото той предложи през 1983 г. Въпреки това широкото клинично приложение е получено едва в средата на 90-те години на ХХ век.

Нека да разгледаме терминологията, какво представлява – ДНК и т.н. Всяка клетка от всяко живо същество (животно, растение, човек, бактерия, вирус) има хромозоми. Хромозомите са покровители на генетичната информация, които съдържат цялата последователност на гените на всяко отделно живо същество.

Всяка хромозома се състои от две направления на ДНК, усукани в една спирала една спрямо друга. ДНК е химична дезоксирибонуклеинова киселина, която се състои от структурни компоненти – нуклеотиди. Има пет вида нуклеотиди – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (D), цитозин (С) и урацил (U). Нуклеотидите се подреждат един след друг в строга индивидуална последователност, образувайки гени. Един ген може да се състои от 20-200 такива нуклеотиди. Например, генът, който кодира производството на инсулин, се състои от 60 двойки нуклеотиди.

Нуклеотидите притежават свойството на взаимно допълване. Това означава, че противоположно на аденин (А) в една ДНК верига е задължително тимин (Т) в друга верига, а противоположно на гуанина (D) е цитозин (С). Схемата изглежда така:

D – D

Т – А

A – T

Това свойство на взаимно допълване е ключ към PCR.

В допълнение към ДНК същата структура има РНК – рибонуклеинова киселина, която се различава от ДНК, тъй като вместо тимин използва урацил. РНК – е попечител на генетична информация в някои вируси, които се наричат ​​ретровируси (напр. ХИВ).

         ДНК и РНК молекулите могат да „се размножават“ (това свойство се използва за PCR). Това се случва по следния начин: две нишки от ДНК или РНК, отделени една от друга, се засаждат специални ензими върху всяка верига, която синтезира нова верига. Синтезът протича съгласно принципа на допълняемост, т.е. ако има нуклеотид А в оригиналната ДНК верига, тогава в новоза синтезираната ще има T, ако Т е C и т.н. Този специален ензим „строител“ се нуждае от „праймер“, за да започне синтеза – последователност от 5-15 нуклеотида. Това „семена“ се определя експериментално за всеки ген (генът за хламидиите, микоплазмата, вирусите).

Така че всеки PCR цикъл се състои от три етапа. В първия етап има така нареченото разкъсване на ДНК – тоест разделянето на две свързани ДНК вериги. Във второто място, „семена“ е прикрепено към мястото на ДНК веригата. И накрая, разширяването на тези ДНК нишки, което се произвежда от ензима „строител“. Понастоящем целият сложен процес се извършва в една епруветка и се състои от повтарящи се цикли на ДНК умножение, за да се получи голям брой копия, които могат да бъдат открити по конвенционални методи. Това означава, че от една нишка на ДНК получаваме стотици или хиляди.

Етапи на изследване на PCR

Събиране на биологичен материал за изследване

Като проба служи разнообразен биологичен материал: кръвта и нейните компоненти, урина, слюнка, лигавици, спинална течност, повърхности на раната, които трябва да бъдат разделени, съдържанието на телесните кухини. Всички биологични анализи се събират с инструменти за еднократна употреба и събраният материал се затваря в пластмасови стерилни епруветки или се поставя върху среда за култивиране, последвано от транспортиране до лабораторията.

В събраните проби добавете необходимите реагенти и поставете в програмируем термостат – термоциклер (термоциклер). PCR цикъл, състоящ се от три етапа (денатуриране, отгряване и удължаване) се повтаря 30-50 пъти в термоциклера. Какво означава това? Нека разгледаме по-подробно

Етапи на незабавна реакция на PCR, копиране на генетичен материал

I етап на PCR – Подготовка на генетичен материал за копиране.

Настъпва при температура 95 ° C, докато ДНК нишките са прекъснати и могат да бъдат посяти.

„Спиндели“ се произвеждат промишлено от различни изследователски и производствени сдружения, а лабораториите купуват готови. В същото време „грунд“ за откриване, например, на хламидия, работи само за хламидии и т.н. Следователно, ако биоматериалът се тества за хламидиална инфекция, тогава „семена“ за хламидиите се поставя в реакционната смес; ако тествате биоматериал за вируса на Epstein-Barr, тогава „семената“ за вируса на Epstein-Barr.

II етап – Комбиниране на генетичния материал на причинителя на инфекцията и „засяване“.

Ако има ДНК на вирус или бактерия, „семена“ седи на тази ДНК. Този процес на свързване на „праймера“ е вторият етап от PCR. Този етап се извършва при температура 75 ° С.

Етап III – Копиране на генетичен материал на причинителя на инфекцията.

 Това е процесът на действително удължаване или умножаване на генетичния материал на 72 ° С. Ензимът „строител“ е подходящ за „засяване“ и синтезира нова ДНК верига. С края на синтеза на новата ДНК верига PCR цикълът също завършва. Това означава, че в един цикъл на PCR количеството генетичен материал се удвоява. Например в първата проба има 100 ДНК молекули на вируса, след първия PCR цикъл вече има 200 молекули ДНК от тествания вирус в пробата. Един цикъл продължава 2-3 минути.

 За да се образува достатъчно количество генетичен материал за идентификация, обикновено се извършват 30-50 цикъла на PCR, което отнема 2-3 часа.

Степента на идентификация на умножения генетичен материал

Всъщност, PCR завършва тук и тогава етапът на идентификация е не по-малко важен. За идентификация използвайте метода на електрофореза или етикетите „грундове“. Когато се използва електрофореза, получените ДНК нишки се разделят по размер и наличието на ДНК фрагменти с различни дължини показва положителен резултат от анализа (т.е. наличието на определен вирус, бактерии и т.н.). Когато се използват етикетирани „праймери“, към крайния продукт на реакцията се добавя хромоген (багрило), в резултат на което ензимната реакция се придружава от образуването на цвят. Развитието на цвета директно показва, че вирусът или друг откриваем агент присъства в първоначалната проба.

Към днешна дата, използвайки етикетирани „праймери“, както и съответния софтуер, можете веднага да произведете и „да прочетете“ резултатите от PCR. Това е т.нар. PCR в реално време.

Защо PCR диагностиката е толкова ценна?

Едно от значимите предимства на PCR метода е високата чувствителност – от 95 до 100%. Тези предимства обаче следва да се основават на следното:

1. правилна ограда, транспорт на биологичен материал;
2. наличност на стерилни инструменти за еднократна употреба, специални лаборатории и обучен персонал;
3. стриктно спазване на техниката и стерилност по време на анализа

Чувствителността варира за различните откриваеми микроби. Например, чувствителността на PCR метода за откриване на вируса на хепатит С е 97-98%, чувствителността за откриване на уреаплазма е 99-100%.

Възможностите, присъщи на PCR анализа, позволяват постигането на ненадмината аналитична специфичност. Това означава да се идентифицират точно микроорганизмите, които се търсят, а не сходни или тясно свързани.

Диагностичната чувствителност и специфичността на PCR метода често надхвърлят тези за метода на култивиране, наречен „златен стандарт“ за откриване на инфекциозни заболявания. Като се има предвид продължителността на отглеждането (от няколко дни до няколко седмици), предимството на PCR метода става очевидно.

PCR при диагностицирането на инфекции

Предимствата на метода на PCR (чувствителност и специфичност) определят широк спектър от приложения в съвременната медицина.

Основните области на PCR диагностиката са:

1. диагностика на остри и хронични инфекциозни заболявания с различна локализация
2. контрол на ефективността на терапията
3. спецификация на вида патоген

PCR се използва в акушерството, гинекологията и неонатологията и педиатрията, урологията, венерология, нефрология, инфекциозна болест клиника, офталмологията, неврологията, Phthisiopneumology и сътр.

Използването на PCR диагностика се извършва съвместно с други изследователски методи (ELISA, UIF, RIF и др.). Тяхната комбинация и целесъобразност се определя от лекуващия лекар.

Инфекциозни агенти, открити чрез PCR

вируси:

1. ретровируси HIV-1 и HIV-2
2. херпетиформени вируси
3. херпес симплекс вирус 1 и 2 вида
4. цитомегаловирус
5. Вирус на Epstein-Barr
6. варицела – зостер вирус
7. херпес вируси 6 и 7
8. вирус на хепатит С, В и А
9. човешки папиломавируси
10. вируса на рубеола
11. аденовируси
12. риновирусите
13. парвовирус
14. pikornovirusy

бактерии:

1. микобактерии
2. хламидия
3. микоплазма
4. салмонела
5. Legionella
6. клостридии
7. бледа трепонема
8. различни патогенни видове от Escherichia coli
9. холера вибрио
10. рикетсии
11. Staphylococcus aureus
12.  бактериален патоген на менингит
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. причинителен агент на гонореята
16. дифтерия бацил
17. haemophilus influenzae

Този списък показва най-честите инфекциозни агенти, открити чрез метода на PCR. Всъщност този списък е много по-широк, постоянно попълнен, тъй като се синтезират нови „семена“. Също така се отбелязва, че списъкът на откриваемите патогени се определя от наличието на „семена“ за идентификация в арсенала на всяка отделна лаборатория.

Автор: Nasedkina A.K.

ВАЖНО 👩‍⚕️ Опитах всички, всички рецепти от народната медицина, от разтриване с чесън, вани за крака и гимнастика до компрес с урина. Не мога да кажа, че нещо ми помогна особено.  Решението дойде неочаквано ...

---